JAMA Neurology| 中山三院邱偉/福建附一付瑩/陜西師大閆亞平：國(guó)際創(chuàng)新抗體檢測(cè)，快速診斷神經(jīng)免疫病
9月5日，國(guó)際神經(jīng)病學(xué)頂級(jí)期刊JAMA Neurology（影響因子29）在線發(fā)表了國(guó)際創(chuàng)新技術(shù)-免疫斑點(diǎn)法（IDoT）檢測(cè)水通道蛋白（AQP4）抗體的研究論著。這是目前國(guó)內(nèi)神經(jīng)免疫抗體檢測(cè)首個(gè)發(fā)表于該期刊的研究，在國(guó)際神經(jīng)免疫病研究領(lǐng)域發(fā)出了中國(guó)聲音，也體現(xiàn)了國(guó)際同行對(duì)中國(guó)開(kāi)展國(guó)際臨床合作研究的認(rèn)可。?邱偉（中山三院）、Ho Jin Kim（韓國(guó)NCC）為共同通訊作者；付瑩（福建附一）、畢錦（福建附一）、閆亞平（陜西師大）、孫曉渤（中山三院）為共同第一作者。該研究得到了天津醫(yī)大總醫(yī)院施福東、廣醫(yī)二院龍友明、福建附一李銳等專(zhuān)家的指導(dǎo)。
△原文鏈接：https://jamanetwork.com/journals/jamaneurology/fullarticle/2809143?resultClick=1? ? ?doi:? 10.1001/jamaneurol.2023.2974
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研究背景
視神經(jīng)脊髓炎視譜疾?。∟MOSD）是神經(jīng)免疫病的一種，亞洲女性好發(fā)。NMOSD會(huì)反復(fù)發(fā)作視神經(jīng)炎和脊髓炎，最終造成神經(jīng)功能障礙，給家庭、社會(huì)造成負(fù)擔(dān)。目前，NMOSD診斷依賴(lài)外周血水通道蛋白4（AQP4-IgG）抗體檢測(cè)，因此，基于細(xì)胞表達(dá)的抗體檢測(cè)方法（CBA）于2015年被國(guó)際NMOSD診斷指南推薦，作為當(dāng)今AQP4-IgG抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，CBA法耗時(shí)3-7天，且需要特殊實(shí)驗(yàn)室和技術(shù)人員等，大大限制了CBA法的廣泛使用，尤其在一些NMOSD高發(fā)、但醫(yī)療條件欠發(fā)達(dá)的地域；并且，目前商品化的檢測(cè)試劑盒仍依賴(lài)國(guó)外進(jìn)口，檢測(cè)成本極高。?
△傳統(tǒng)CBA檢測(cè)方法。目前傳統(tǒng)CBA檢測(cè)方法包括活細(xì)胞CBA與固定 CBA，前者需要轉(zhuǎn)染質(zhì)粒使293T細(xì)胞過(guò)表達(dá)AQP4抗原，患者血清樣本作為一抗通過(guò)抗原抗體結(jié)合原理，再通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或者免疫熒光顯微鏡現(xiàn)場(chǎng)觀察患者AQP4-IgG抗體；后者是將轉(zhuǎn)染成功的293T細(xì)胞進(jìn)行固定處理后染色觀察。由于技術(shù)要求高，國(guó)際上僅少數(shù)中心提供活細(xì)胞CBA檢測(cè)，而固定CBA相對(duì)容易獲得，但仍對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器如熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀等要求較高。
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研究概況
解決傳統(tǒng)AQP4-IgG抗體檢測(cè)的瓶頸，是全球神經(jīng)免疫學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)，同時(shí)中國(guó)人作為NMOSD高發(fā)人群，我國(guó)亦迫切需要具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的可靠檢測(cè)方法。面對(duì)臨床需求，中山三院、福建附一、陜西師大與國(guó)際學(xué)者組成聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊(duì)，從臨床問(wèn)題出發(fā)，依托中國(guó)南方NMOSD臨床隊(duì)列，開(kāi)展基礎(chǔ)-臨床結(jié)合的轉(zhuǎn)化研究，共同進(jìn)行抗體檢測(cè)新技術(shù)的研發(fā)與驗(yàn)證。研究過(guò)程中，閆亞平團(tuán)隊(duì)首先利用表達(dá)AQP4的細(xì)胞提取的膜碎片（帶有完整AQP4空間構(gòu)象）作為抗原底物，創(chuàng)建一種高效、易操作的AQP4-IgG檢測(cè)新技術(shù)--IDoT法；之后，邱偉/孫曉渤團(tuán)隊(duì)和付瑩團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合韓國(guó)Kim團(tuán)隊(duì)自主設(shè)計(jì)，并開(kāi)展為期3年（2020年5月-2023年2月）的前瞻性、病例-對(duì)照、國(guó)際多中心交叉驗(yàn)證研究。
△國(guó)際首創(chuàng)IDoT法檢測(cè)AQP4-IgG示意圖。IDoT法創(chuàng)新性地解決了幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)瓶頸：（1）通過(guò)溫和手段獲得過(guò)表達(dá)的AQP4細(xì)胞膜片段，保留完整空間構(gòu)象的OAP結(jié)構(gòu)，以保持其抗原性；（2）獲得高濃度對(duì)照細(xì)胞（不表達(dá)AQP4的239T細(xì)胞）；（3）通過(guò)膜碎片預(yù)處理，清除血清中非特異性蛋白，顯著降低背景色。
該研究在中國(guó)（廣東、福建）和韓國(guó)共檢測(cè)836例患者的血清樣本。結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)CBA法對(duì)比（活細(xì)胞CBA法或者固定CBA法等），IDoT法的抗體檢測(cè)性能與CBA相當(dāng)，診斷性研究結(jié)果Kappa系數(shù)為98.0%（400例患者）；436例驗(yàn)證者，包括275例其他疾病隊(duì)列（風(fēng)濕免疫疾病等）、57例NMOSD前瞻性隨訪隊(duì)列、31例國(guó)內(nèi)交叉驗(yàn)證隊(duì)列、73例韓國(guó)神經(jīng)免疫疾病隊(duì)列交叉驗(yàn)證（NMOSD、MOGAD等），整體驗(yàn)證隊(duì)列結(jié)果中，僅2例與CBA檢測(cè)不一致。因此，IDoT總體敏感性為99.4%（95%CI:97.8%- 99.9%），特異性為99.2%（95%CI:98.0%- 99.8%）。
△前瞻性、病例-對(duì)照、國(guó)際多中心交叉驗(yàn)證研究流程圖
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△韓國(guó)隊(duì)列交叉驗(yàn)證研究流程圖和結(jié)果
該研究證明，IDoT法與目前金標(biāo)準(zhǔn)CBA法具有相同檢測(cè)效能。但I(xiàn)DoT法高效、易操作，可實(shí)現(xiàn)在普通實(shí)驗(yàn)室、一般技術(shù)人員、廣泛人群中進(jìn)行AQP4-IgG抗體檢測(cè)，在快速篩查中具有更廣泛的應(yīng)用前景，可實(shí)現(xiàn)NMOSD患者早診斷早治療，同時(shí)為資源較少和經(jīng)驗(yàn)不足的基層醫(yī)院以及其他經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國(guó)家提供一種可選擇方法，最終實(shí)現(xiàn)提高AQP4-IgG抗體檢測(cè)率。
△傳統(tǒng)CBA法需要特殊設(shè)備等，難以廣泛開(kāi)展；IDoT法有望在普通實(shí)驗(yàn)室，由一般的技術(shù)人員經(jīng)培訓(xùn)后掌握使用，未來(lái)可能在社區(qū)人群疾病篩查，甚至患者自行檢測(cè)中應(yīng)用。
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研究意義
該研究成果是我國(guó)的自主研發(fā)成果，有效解決國(guó)內(nèi)神經(jīng)免疫抗體檢測(cè)的“卡脖子”問(wèn)題，也填補(bǔ)了國(guó)際上快速檢測(cè)AQP4-IgG抗體領(lǐng)域的空白，對(duì)于推動(dòng)全球NMOSD的早期精確診斷具有重要意義。同時(shí)，我國(guó)對(duì)該成果自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的擁有，未來(lái)將大大降低NMOSD診斷成本，促進(jìn)患者群體早診斷早干預(yù)，減輕家庭與國(guó)家的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。JMMA Neurology?在全球享有很高的聲譽(yù)和影響力，研究論文得到了JMMA Neurology?雜志多個(gè)審稿人的高度評(píng)價(jià)，認(rèn)為 “這項(xiàng)非常詳實(shí)的研究將引起神經(jīng)科醫(yī)生的極大興趣，克服在不同醫(yī)療條件下NMOSD抗體檢測(cè)的障礙”、“該研究發(fā)現(xiàn)將對(duì)NMOSD抗體檢測(cè)領(lǐng)域產(chǎn)生重大影響”、“該研究是神經(jīng)免疫抗體檢測(cè)技術(shù)的重大進(jìn)步”。
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△克服疫情影響，研究人員與國(guó)際神經(jīng)免疫專(zhuān)家（澳大利亞西澳大學(xué)Allan Kermode、美國(guó)梅奧診所Sean Pittock、日本九州大學(xué)Noriko Isobe）反復(fù)開(kāi)展線上課題討論。
